293來源病毒包裝細胞；ΦA培養步驟:

一、復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加4-6mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜(或將細胞懸液加入6cm皿中),培養過夜。每天換液并檢查細胞密度。

二、細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養。

a)、對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:

1. 棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的培養基終止消化。

3.輕輕吹打細胞,脫落后吸出,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補加培養液,將細胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。

b)、對于懸浮細胞,傳代可參考以下方法:

方法一:收集細胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄上清液,補加1-2ml培養液后吹勻,將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或瓶中。

方法二:可選擇半數換液方式,棄半數培養基后,將剩余細胞懸起,將細胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養基新皿中或者瓶中。

PS:若客戶收到2ml小管細胞,收到細胞后,用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內,嚴格無菌操作;將小管細胞轉移至T25培養瓶或6cm培養皿,加入5ml左右培養基混勻,放入培養箱過夜培養后查看細胞密度:若密度未超過80%,換液繼續培養,視情況傳代或者凍存。若密度超過80%,可直接進行傳代(方法同上)。

三、細胞凍存:(注:無血清凍存液凍存細胞的方法

1、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時,棄25cm2培養瓶中的培養液,用PBS清洗細胞一次;

2、添加0.25%消化液約1ml至培養瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入培養液終止消化,輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉移至15ml離心管中,1000rpm離心5min;

3、用適量的凍存液重懸細胞,并放置于凍存管中;

4、先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,然后將其移入-80℃